Objavljeno u NN 142/08 od 10.12.2008.:

 

MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJA

Na temelju članka 17. stavka 3. Zakona o veterinarstvu (»Narodne novine«, br. 41/07) ministar poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

 

PRAVILNIK O PLANOVIMA UZORKOVANJA I DIJAGNOSTIČKIM METODAMA ZA OTKRIVANJE I POTVRĐIVANJE ODREĐENIH BOLESTI RIBA[1]

Članak 1.

Ovim se Pravilnikom utvrđuju planovi uzorkovanja i dijagnostičkih metoda za otkrivanje i potvrđivanje virusne hemoragijske septikemije (VHS) i zarazne hematopoetske nekroze (ZHN).

Članak 2.

Dodatak je tiskan u prilogu Pravilnika i njegov je sastavni dio.

Članak 3.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od dana objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 011-02/08-01/34

Urbroj: 525-6-08-1

Zagreb, 13. studenoga 2008.

Ministar mr. sc. Božidar Pankretić, v. r.

DODATAK

PLANOVI UZORKOVANJA I DIJAGNOSTIČKE METODE ZA OTKRIVANJE I POTVRĐIVANJE VIRUSNE HEMORAGIJSKE SEPTIKEMIJE (VHS) I ZARAZNE HEMATOPOETSKE NEKROZE (ZHN)

UVOD

Ovaj Dodatak:

(a) propisuje smjernice i utvrđuje minimalne zahtjeve u vezi s planovima uzorkovanja i dijagnostičkim metodama za otkrivanje i potvrđivanje prisutnosti virusne hemoragijske septikemije (VHS) i zarazne hematopoetske nekroze (ZHN);

(b) uključuje odredbe Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[2] za odobravanje i održavanje statusa zona i uzgajališta u neodobrenim zonama;

(c) utvrđuje odredbe čiji je cilj odgovarajuća dijagnoza VHS-a i ZHN-a te službeno priznavanje statusa zona i uzgajališta u neodobrenim zonama u skladu s člancima 49., 50. i 51. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[3];

(d) namijenjen je tijelima koja su nadležna za kontrolu VHS-a i ZHN-a te laboratorijskom osoblju koje provodi testiranja vezana uz te bolesti. Sukladno tome, naglasak je stavljen na postupke uzorkovanja, načela te primjenu laboratorijskih testova i procjena njihovih rezultata kao i na sveobuhvatne laboratorijske tehnike. Prema potrebi, laboratoriji mogu unijeti izmjene u testove opisane u ovom Dodatku ili koristiti drugačije testove, pod uvjetom da se može dokazati jednaka osjetljivost i specifičnost.

Dio I. ovoga Dodatka uključuje planove uzorkovanja i dijagnostičke metode za nadziranje VHS-a i ZHN-a kako bi se postigao i zadržao status odobrene zone ili status odobrenog uzgajališta u neodobrenoj zoni.

U Dijelu II. ovoga Dodatka opisuju se dijagnostički postupci za potvrđivanje VHS-a i ZHN-a u slučaju sumnje.

U Dijelu III. ovoga dodatka utvrđuju se kriteriji i smjernice za provedbu službenih programa pregleda zdravlja kojim se potvrđuje odsutnost VHS-a i/ili ZHN-a u prošlosti.

U Dijelu IV. ovoga Dodatka daju se preporuke za postupak titracije virusa VHS-a i ZHN-a kako bi se provjerila osjetljivost staničnih kultura na infekciju.

Akronimi i kratice navedeni su u Dijelu V. ovoga Dodatka.

DIO I. Planovi uzorkovanja i dijagnostičke metode za nadziranje VHS-a i ZHN-a radi postizanja i zadržavanja statusa odobrene zone ili statusa odobrenog uzgajališta u neodobrenoj zoni

Poglavlje I. PREGLEDI I UZORKOVANJE

1. Opće odredbe o kliničkim pregledima, sakupljanju i odabiru uzoraka za nadziranje zona ili uzgajališta u neodobrenim zonama radi postizanja ili zadržavanja odobrenog statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN

1.1. U tablicama 1A, 1B i 1C ovoga Dodatka daje se sažeti prikaz kliničkih pregleda i uzorkovanja tkiva riba i/ili ovarijalne tekućine koji moraju biti provedeni u zonama ili uzgajalištima u neodobrenim zonama kako bi se postigao ili zadržao odobreni status obzirom na VHS i/ili ZHN u skladu s Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[4]. Daljnji podaci navedeni su u Dijelu I. Poglavlju I. točkama 2 do 4. te Tablici 1A i 1B ovoga Dodatka ne primjenjuju se na nova uzgajališta i uzgajališta koja ponovo započinju svoju djelatnost s ribama, ikrom ili gametama iz odobrene zone ili odobrenog uzgajališta smještenog u neodobrenoj zoni, pod uvjetom da udovoljavaju zahtjevima propisanim Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[5].

1.2. Klinički pregledi moraju biti provedeni u razdoblju od listopada do lipnja ili kada je temperatura vode niža od 14°C. U onim uzgajalištima u kojima se klinički pregledi trebaju provesti dva puta godišnje, vremenski razmak između pregleda mora iznositi najmanje četiri mjeseca. Sve se proizvodne jedinice (ribnjaci, bazeni, kavezi itd.) moraju pregledati kako bi se utvrdila prisutnost uginulih ili oslabljenih riba ili riba s neuobičajenim ponašanjem. Posebnu pažnju treba obratiti na područje ispusta vode gdje se zbog vodene struje obično sakupljaju oslabljene ribe.

1.3. Ribe za uzorkovanje trebaju biti odabrane se na sljedeći način:

– ukoliko su prisutne kalifornijske pastrve, samo ribe te vrste moraju biti odabrane za uzorkovanje. Ukoliko kalifornijska pastrva nije prisutna, uzorak se mora sastojati od riba svih drugih vrsta prijemljivih na virus VHS i/ili ZHN (kao što je propisano u Pravilniku o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[6]. Navedene vrste moraju biti razmjerno zastupljene u uzorku;

– ukoliko se za proizvodnju riba koristi više vodotokova, uzorak se mora sastojati od riba iz svih vodotokova;

– ukoliko su prisutne oslabljene ribe, ribe s neuobičajenim ponašanjem ili svježe uginule ribe (koje još nisu u stanju raspadanja), takve ribe potrebno je primarno odabrati. Ukoliko takve ribe nisu dostupne, odabrane ribe moraju uključivati zdrave ribe normalnog izgleda koje treba sakupiti tako da u uzorku budu razmjerno zastupljeni svi dijelovi uzgajališta kao i sve dobne kategorije.

2. Posebne odredbe, uključujući sakupljanje uzoraka, za nadziranje zona ili uzgajališta u neodobrenim zonama u svrhu postizanja ili zadržavanja odobrenog statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN

2.1. Zona ili uzgajalište u neodobrenoj zoni, koje je pod nadzorom nadležnih službi, može dobiti status odobrene zone odnosno uzgajališta s obzirom na VHS i/ili ZHN prema jednom od sljedećih modela:

(a) Model A – dvogodišnji program nadziranja

Nakon najmanje dvogodišnje odsutnosti bilo kojeg kliničkog ili drugog znaka VHS-a i/ili ZHN-a, sva uzgajališta u zoni ili bilo koje uzgajalište u neodobrenoj zoni, koji će biti odobreni, moraju tijekom dvije godine biti podvrgnuti kliničkom pregledu dva puta godišnje. U tom dvogodišnjem kontrolnom razdoblju koje prethodi postizanju odobrenog statusa odsutnost kliničkih ili drugih znakova VHS-a i/ili ZHN-a mora biti stalna i moraju se prikupljati uzorci za ispitivanje u skladu s tablicom 1.A ovoga Dodatka. Uzorci se moraju odabirati, pripremati i ispitivati kako je opisano u Poglavljima I. do IV. ovoga Dijela, a laboratorijska ispitivanja moraju dati negativne rezultate s obzirom na VHS i/ili ZHN; ili

(b) Model B – dvogodišnji program nadziranja sa smanjenom veličinom uzorka

Nakon provedenog službenog programa pregleda zdravlja kojim je dokumentirano odsustvo VHS-a i/ili ZHN-a tijekom najmanje četiri prethodne godine, sva uzgajališta u zoni ili bilo koje uzgajalište u neodobrenoj zoni koji treba biti odobren, moraju biti zdravstveno pregledani dva puta godišnje tijekom dvije godine. Tijekom dvogodišnjeg kontrolnog razdoblja koje prethodi postizanju odobrenog statusa, odsutnost kliničkih ili drugih znakova VHS-a i/ili ZHN-a mora biti stalna i moraju biti prikupljeni uzorci za pretraživanje u skladu s tablicom 1.B ovoga Dodatka.Uzorci moraju biti odabrani, pripremljeni i pretraženi kako je opisano u Poglavljima I. do IV. ovoga Dijela, a rezultati laboratorijskih pretraživanja moraju biti negativni na VHS i/ili ZHN. Da bi se program zdravstvenih kontrola kojim se dokumentira odsutnost VHS-a i/ili ZHN-a mogao prihvatiti, mora ispunjavati kriterije i smjernice iz Dijela III. ovoga Dodatka.

2.2. Posebne odredbe za odobravanje novih uzgajališta i uzgajališta koja ponovo započinju svoju djelatnost s ribama, ikrom ili gametama iz odobrene zone ili iz odobrenog uzgajališta u neodobrenoj zoni.

Nova uzgajališta i uzgajališta koja ponovo započinju svoju djelatnost s ribama, ikrom ili gametama iz odobrene zone ili iz odobrenog uzgajališta u neodobrenoj zoni mogu steći status u skladu s uvjetima propisanim Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[7]. U skladu s navedenim, na ta se uzgajališta ne primjenjuju odredbe o uzorkovanju koje su propisane u modelu A i B (točka 2.1. podtočke (a) i (b) ovoga Poglavlja.

2.3. Program nadziranja za održavanje odobrenog statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN

Da bi zona ili uzgajalište u neodobrenoj zoni zadržali odobreni status s obzirom na VHS i/ili ZHN, pregledi i uzimanje uzoraka za pretraživanje moraju se provoditi u skladu s tablicom 1C ovoga Dodatka. Uzorci moraju biti odabrani, pripremljeni i pretraženi u skladu s Poglavljima I. do IV. ovoga Dijela, a rezultati laboratorijskih pretraga moraju biti negativni na uzročnike VHS-a i/ili ZHN-a.

3. Pripremanje i slanje uzoraka ribe

3.1. Prije slanja ili prijevoza u laboratorij, dijelovi organa koji će se pretraživati moraju biti uzeti iz ribe pomoću sterilnog sekcionog pribora i preneseni u sterilne plastične epruvete koje sadrže transportni medij tj. medij za staničnu kulturu s 10% telećeg seruma i antibioticima. Preporuča se kombinacija od 200 ij penicilina, 200 μg streptomicina i 200 μg kanamicina po mililitru (ml), ali se mogu koristiti i drugi antibiotici dokazane djelotvornosti. Tkiva za pretragu su slezena, prednji bubreg i, dodatno, ili srce ili encefalon. U nekim slučajevima mora biti pretražena ovarijalna tekućina (tablice 1A do 1C ovoga Dodatka).

3.2. Ovarijalna tekućina ili dijelovi organa od najviše 10 riba (tablice 1A do 1C ovoga Dodatka) mogu se prikupiti u jednu sterilnu epruvetu koja sadrži najmanje 4 ml transportnog medija i koja predstavlja jedan skupni uzorak. Određeno tkivo u svakom uzorku mora težiti najmanje 0,5 grama (g).

3.3. Epruvete treba smjestit u izolirane posude (npr. polistirenske kutije debelih stijenki) zajedno s dovoljnom količinom leda ili ulošcima za frižider koji će osigurati hlađenje uzoraka tijekom prijevoza do laboratorija. Treba izbjeći zamrzavanje. Tijekom prijevoza temperatura uzorka ne smije biti iznad 10°C, a pri njegovom prijemu led mora još uvijek biti prisutan u transportnoj kutiji odnosno jedan ili više uložaka za frižider moraju još uvijek biti djelomično ili u cijelosti smrznuti.

3.4. Virološko pretraživanje mora započeti što je prije moguće, a najkasnije 48 sati nakon prikupljanja uzoraka. U iznimnim[8] slučajevima virološko pretraživanje može započeti najkasnije unutar 72 sata od prikupljanja materijala, pod uvjetom da je materijal za pretragu zaštićen transportnim medijem i da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza (točka 3.3. ovoga Poglavlja).

3.5. U laboratorij se mogu poslati cijele ribe pod uvjetom da se mogu ispuniti zahtjevi u odnosu na temperaturu tijekom prijevoza. Cijele ribe mogu biti umotane u upijajući papir i potom poslane u plastičnim vrećicama ohlađenim kako je gore navedeno. Mogu biti poslane i žive ribe.

3.6. Pakiranje i označavanje mora biti provedeno u skladu s odgovarajućim važećim nacionalnim i međunarodnim propisima o prijevozu.

4. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

U dogovoru s uključenim dijagnostičkim laboratorijem i druga tkiva riba se mogu prikupiti i pripremiti za dodatna pretraživanja.

Poglavlje II. PRIPREMA UZORAKA ZA VIROLOŠKE PRETRAGE

1. Zamrzavanje u iznimnim slučajevima

Kada je zbog praktičnih poteškoća (npr. loši vremenski uvjeti, neradni dani, problemi u laboratoriju itd.) nemoguće nasaditi stanice u roku od 48 sati nakon prikupljanja uzoraka tkiva, uzorci tkiva se mogu zamrznuti u mediju za staničnu kulturu na temperaturi od – 20°C ili nižoj, a virološke pretrage obaviti unutar 14 dana. Tkivo se može zamrznuti i odmrznuti samo jednom prije pretraživanja. Mora se voditi evidencija sa svim podacima o razlozima za svako zamrzavanje uzoraka tkiva (kao što je nevrijeme, propadanje staničnih linija itd.)

2. Homogenizacija organa

Tkiva iz epruveta u laboratoriju se moraju potpuno homogenizirati (ili u homogenizatoru Stomacher ili miješalici ili tarioniku i tučku sa sterilnim pijeskom) i potom suspendirati u izvornom transportnom mediju.

Ukoliko se uzorak sastoji od cijelih riba kraćih od 4 cm, one se moraju usitniti sterilnim škarama ili skalpelom nakon što se ukloni stražnji dio tijela iza crijevnog otvora. Ukoliko uzorak čine cijele ribe dužine tijela od 4 do 6 cm, uzima se utroba uključujući bubrege. Ukoliko uzorak čine cijele ribe dulje od 6 cm, uzimaju se uzorci tkiva kako je opisano u točki 3. ovoga Poglavlja. Uzroke tkiva treba usitniti sterilnim škarama ili skalpelom, homogenizirati kako je gore opisano i suspendirati u transportnom mediju.

Konačni omjer tkiva i transportnog medija mora se u laboratoriju postaviti u omjer 1:10.

3. Centrifugiranje homogenizata

Homogenizat se centrifugira u centrifugi ohlađenoj pri 2 do 5°C na brzini 2000 do 4000 x g u trajanju 15 minuta, i taj se supernatant prikuplja i obrađuje ili četiri sata na 15°C ili preko noći na 4°C sa antibioticima; u ovoj fazi može biti koristan gentamicin 1 mg/ml.

Ukoliko je uzorak poslan u transportnom mediju (tj. izložen antibioticima), može se izostaviti obrada supernatanta antibioticima.

Svrha obrade antibioticima je suzbijanje bakterijske kontaminacije uzorka, tako da nije potrebna filtracija kroz membranske filtre.

Ukoliko se prikupljeni supernatant pohrani na –80°C unutar 48 sati od prikupljanja, može se još samo jednom ponovo upotrijebiti za virološke pretrage.

Ako je zbog praktičnih poteškoća (npr. kvar inkubatora, problemi sa staničnim kulturama itd.) nemoguće inokulirati stanice unutar 48 sati od prikupljanja uzoraka tkiva, supernatant se može zamrznuti na temperaturi od –80°C, a virološko pretraživanje obaviti unutar 14 dana.

Prije inokulacije stanica, supernatant se pomiješa s jednakim dijelovima odgovarajuće razrijeđenih skupina antiseruma za lokalne serotipove virusa ZNG te se s njima inkubira najmanje jedan sat na 15°C ili najviše 18 sati na 4°C. Titar antiseruma mora biti najmanje 1/2000 s neutralizacijom plaka od 50% u testu neutralizacije.

Svrha tretiranja svih inokuluma antiserumom za virus ZNG (virus koji se u nekim dijelovima Europe javlja u 50% uzoraka ribe) je spriječiti da se u inokuliranim staničnim kulturama razvije citopatogeni učinak (CPE) zbog virusa ZNG. To će skratiti trajanje viroloških pretraga i smanjiti broj slučajeva u kojima bi se pojava CPU-a morala smatrati potencijalnim znakom prisutstva virusa VHS-a ili ZHN-a.

Ako uzorci potječu iz proizvodnih jedinica koje se smatraju slobodnim od ZNG-a, može se izostaviti tretiranje inokuluma antiserumom za virus ZNG-a.

Poglavlje III. VIROLOŠKE PRETRAGE

1. Stanične kulture i medij

Stanice BF-2 ili RTG-2 i EPC ili FHM umnožavaju se na temperaturi od 20 do 30°C u odgovarajućem mediju, npr. Eaglovom MEM-u (ili njegovim modifikacijama), obogaćenom s 10% fetalnog goveđeg seruma i antibioticima u standardnim koncentracijama.

Ako se stanice umnažaju u zatvorenim posudama, preporučuje se puferiranje medija bikarbonatom. Medij koji se koristi za kulturu stanica u otvorenim jedinicama može se puferirati Tris-HCL-om (23 mM) i Na-bikarbonatom (6 mM). Ph mora biti 7,6 ± 0,2.

Stanične kulture koje će se koristiti za inokuliranje s tkivnim materijalom trebaju biti mlade (stare 4 do 48 sati) i pri inokuliranju moraju biti u fazi aktivnog rasta (bez zgrušavanja).

2. Inokulacija staničnih kultura

Suspenzija organa tretirana antibioticima inokulira se u stanične kulture u dva razrjeđenja, tj. osnovnom razrjeđenju i, pored toga, njegovom razrjeđenju 1:10, što dovodi do konačnih razrjeđenja tkivnog materijala u staničnoj kulturi 1:100 odnosno 1:1000 (kako bi se spriječila homologna interferencija). Moraju se inokulirati najmanje dvije stanične linije (vidi točku 1. ovoga Poglavlja). Omjer veličine inokuluma i količine stanične kulture treba biti 1:10.

Za svako razrjeđenje i svaku staničnu liniju mora se upotrijebiti najmanje oko 2 cm2 površine stanica, što odgovara jednoj jažici na 24 jažičnoj plitici za staničnu kulturu. Preporučuje se korištenje plitica za staničnu kulturu, ali su prihvatljive i druge jedinice sa sličnim ili većim površinama za rast.

3. Inkubacija staničnih kultura

Inokulirane stanične kulture inkubiraju se 7 do 10 dana pri 15°C. Ako se boja medija za staničnu kulturu promijeni s crvene u žutu, što ukazuje na zakiseljenje medija, mora se prilagoditi pH pomoću sterilne otopine bikarbonata ili odgovarajućim tvarima kako bi se osigurala osjetljivost stanica na virusnu infekciju.

Najmanje svakih šest mjeseci ili ako se sumnja na smanjenu osjetljivost stanica, obavlja se titracija zamrznutih pohranjenih virusa VHS-a i ZHN-a kako bi se verificirala osjetljivost staničnih kultura na infekciju. Preporučeni postupak opisan je u Dijelu IV. ovoga Dodatka.

4. Mikroskopiranje

Inokulirane stanične kulture moraju se redovito pregledavati (najmanje tri puta tjedno) na pojavu citopatogenog učinka (CPU) pri povećanju od 40 do 150 puta. Ako se opazi očiti citopatogeni učinak (CPU), odmah treba početi s postupkom identifikacije virusa u skladu s Poglavljem IV. ovoga Dijela.

5. Supkultiviranje

Ako se nakon primarne inkubacije od 7 do 10 dana ne razvije citopatogeni učinak (CPU), provodi se supkultiviranje na svježim staničnim kulturama korištenjem površine slične površini primarne kulture.

Alikvoti hranjive podloge (supernatant) svih kultura/jažica, koje čine primarnu kulturu, puliraju se prema staničnoj liniji 7 do 10 dana nakon inokulacije. Tako dobiveni skupni uzorci inokuliraju se u homologne stanične kulture, nerazrijeđene i razrijeđene 1:10 (pri čemu se dobiju konačna razrijeđena supernatanta u omjeru 1:10 odnosno 1:100), kako je opisano u točki 2. ovoga Poglavlja. Druga je mogućnost da se alikvoti 10% hranjive podloge koja čini primarnu kulturu inokuliraju izravno u jažicu sa svježom staničnom kulturom (supkultiviranje iz jažice u jažicu). Inokulaciji može prethoditi preinkubacija razrjeđenja s antiserumom za virus IPN u odgovarajućem razrjeđenju kako je opisano u Poglavlju II. točki 3. ovoga Dijela.

Inokulirane kulture se potom inkubiraju 7 do 10 dana pri 15°C i promatraju kako je opisano u točki 4.ovoga Poglavlja.

Ako se tijekom prva tri dana inkubacije javi toksični CPU, u toj se fazi može provesti supkultivacija, ali se stanice potom moraju inkubirati sedam dana i ponovo supkultivirati uz dodatnih sedam dana inkubacije. Ako se toksični CPU razvije nakon tri dana, stanice se mogu jednom staviti u pasažu i inkubirati dok ne prođe ukupno 14 dana od primarne inokulacije. U zadnjih sedam dana inkubacije ne smiju se javiti znaci toksičnosti.

Ako unatoč obradi antibioticima dođe do bakterijske kontaminacije, prije supkultivacije treba provesti centrifugiranje na 2000 do 4000 x g kroz 15 do 30 minuta pri 2 do 5°C i/ili filtriranje supernatanta kroz filtar od 0,45 μm (membrana s niskom sposobnošću vezanja proteina). Pored toga, postupak supkultivacije isti je kao i za toksični CPU.

Poglavlje IV. IDENTIFIKACIJA VIRUSA

1. Testovi za identifikaciju virusa

Ako se u staničnoj kulturi uoči postojanje CPU-a, medij (supernatant) se sakupi i pretraži korištenjem jedne ili više sljedećih metoda: neutralizacija, IF, ELISA. Ako se ovim testovima ne može sa sigurnošću identificirati virus u roku od jednog tjedna, supernatant se mora proslijediti u nacionalni referentni laboratorij ili u referentni laboratorij Europske unije za bolesti riba kako bi se virus odmah identificirao.

2. Neutralizacija

Iz sakupljenog supernatanta uklonite stanice centrifugiranjem (2000 do 4000 x g) ili membranskim filtriranjem kroz filter s membranom (0,45 μm) s niskom apsorpcijom proteina te razrijedite supernatant 1:100 i 1:10000 u mediju za staničnu kulturu.

Alikvoti dvaju razrjeđenja supernatanta se pomiješaju i odvojeno inkubiraju 60 minuta pri 15°C s jednakim dijelovima sljedećih reagensa:

– serum koji sadrži skupinu specifičnih protutijela za virus VHS u razrjeđenju 1:50 (vol:vol)[9]

– serum koji sadrži skupinu specifičnih protutijela za virus ZHN u razrjeđenju 1:50 (vol:vol)[10]

– skupni uzorak antiseruma za lokalne serotipove virusa ZNG u razrjeđenju 1:50 (vol:vol)[11]

– sam medij (pozitivna kontrola).

Za svaku mješavinu supernatanta virusa i seruma se najmanje dvije stanične linije inokuliraju s 50 μl i inkubiraju pri 15°C. Razvoj citopategenog učinka (CPU) provjerava se kako je opisano u Poglavlju III. točki 4. ovoga Dijela.

Neki sojevi virusa VHS ne reagiraju u neutralizacijskom testu. Takvi se izolati moraju identificirati metodom IF ili ELISA.

Mogu se primijeniti i drugi neutralizacijski testovi dokazane djelotvornosti.

3. IF

Za svaki izolat virusa koji treba identificirati, najmanje osam pokrovnih stakalaca ili njihovih ekvivalenata treba nasaditi stanicama u gustoći tako da se postigne približno 60 do 90%-tna konfluencija 24 sata nakon nasađivanja. U tu se svrhu preporučuju stanice EPC jer one snažno prianjaju za staklenu površinu, ali se mogu koristiti i druge stanične linije kao što su BF-2, RTG-2 ili FHM.

Nakon što se stanice natalože na staklenu površinu (otprilike jedan sat nakon nasađivanja) ili nakon što su kulture bile inkubirane u razdoblju do 24 sata, inokulira se virus koji treba biti identificiran Četiri kulture se inokuliraju u volumnom omjeru 1:10, a četiri kulture u omjeru 1:1000. One se potom inkubiraju 20 do 30 sati pri 15°C.

Nakon inkubacije, kulture se dva puta ispiru u Eaglovom MEM-u bez seruma, fiksiraju u 80%-tnom ledeno hladnom acetonu i potom boje dvoslojnim IFAT-om. Prvi sloj reagensa sastoji se od poliklonalnih ili monoklonalnih protutijela referentne kvalitete. Drugi sloj reagensa je fluorokromom konjugirani antiserum za imunoglobulin korišten u prvom sloju. Za svaki pretraživani antiserum mora se obojiti najmanje jedna kultura inokulirana visokom dozom i jedna kultura inokulirana niskom dozom. U test se moraju uključiti i odgovarajuće negativne i pozitivne kontrole. Preporučuju se fluorokromi kao što su FITC i TRITC.

Na obojene kulture nanesite fiziološku otopinu s dodatkom glicerola. Pregledajte ih pod ulaznim ultraljubičastim svjetlom. Koristite okulare s povećanjem od 10 ili 12 puta te objektive s povećanjem od 25 ili 40 puta, s numeričkim otvorima > 0,7 odnosno 1,3.

Gore opisani postupak imunofluorescencije (IF) naveden je kao primjer. Umjesto njega mogu se koristiti i drugi postupci imunofluorescencije (s obzirom na stanične kulture, fiksiranje i protutijela referentne kvalitete) dokazane učinkovitosti.

4. ELISA

Jažice na mikrotitarskoj plitici prekriju se preko noći preporučenim razrjeđenjima pročišćenih frakcija imunoglobulina protutijela referentne kvalitete.

Nakon ispiranja jažica puferom PBS-Tween-20, u njih se dodaje virus koji treba identificirati, i to u serijama dvostrukog ili četverostrukog razrjeđenja, te se ostavi da reagira s adsorbiranim protutijelom 60 minuta pri 37°C. Nakon ispiranja puferom PBS-Tween-20, dodaju se biotinom obilježena protutijela čija specifičnost odgovara specifičnosti adsorbiranih protutijela te se ostave da reagiraju 60 minuta pri 20°C. Nakon još jednog ispiranja kao što je gore opisano, dodaje se streptavidin konjugiran s peroksidazom hrena (HRP) te se ostavi da reagira jedan sat pri 20°C. Nakon zadnjeg ispiranja, vezani enzim se vizualizira uporabom odgovarajućih supstrata ELISA (OPD ili drugi).

Gore opisana verzija metode ELISA, koja se temelji na primjeni biotina i avidina, navedena je samo kao primjer. Mogu se koristiti i druge inačice metode ELISA dokazane učinkovitosti.

Tablica 1A: Shema pregleda i uzorkovanja za zone i za uzgajališta u neodobrenim zonama za dvogodišnje kontrolno razdoblje prije dobivanja odobrenog statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN (u skladu s Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[12] i odredbama Dijela I. ovoga Dodatka)

Najveći broj riba u skupnom uzorku: 10

Tablica 1B: Shema pregleda i uzorkovanja za dvogodišnje kontrolno razdoblje prije dobivanja odobrenog statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN za zone i uzgajališta u neodobrenim zonama za koje je službeno dokumentirano odsustvo ovih bolesti u prošlosti (u skladu s Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[13] i odredbama Dijela I. i III. ovoga Dodatka)

Najveći broj riba u skupnom uzorku: 10

TablicA 1C: Shema pregleda i uzorkovanja za zone i uzgajališta u neodobrenim zonama sa svrhom održavanja statusa s obzirom na VHS i/ili ZHN (u skladu s Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08)[14] i odredbama Dijela I. ovoga Dodatka)

Najveći broj riba u skupnom uzorku: 10

DIO II. Dijagnostički postupci za potvrđivanje VHS-a i ZHN-a u slučaju sumnje na pojavu bolesti

Za dijagnosticiranje VHS-a i ZHN-a primjenjuje se jedna ili više sljedećih metoda:

– Uobičajeno izdvajanje virusa nakon kojeg slijedi serološka identifikacija virusa (Odjeljak A.)

– Izdvajanje virusa uz istodobnu serološku identifikaciju virusa (Odjeljak B.)

– Druge dijagnostičke metode – IFAT, ELISA (Odjeljak C.)

Potvrđivanje prvog slučaja VHS-a i/ili ZHN-a u uzgajalištima smještenim u odobrenim zonama ne smije se temeljiti isključivo na metodi iz Odjeljka C. ovoga Dijela. Treba primijeniti i metodu iz Odjeljaka A. ili B. ovoga Dijela.

U nekim se slučajevima, uz tkivni materijal za virološko pretraživanje mora priložiti i dodatni materijal za bakteriološko, parazitološko, histološko ili drugo pretraživanje u svrhu diferencijalnog dijagnosticiranja.

Odjeljak A. Uobičajeno izdvajanje virusa nakon kojeg slijedi serološka identifikacija virusa

I.1. Odabir uzoraka

Za pretraživanje treba prikupiti najmanje 10 riba koje pokazuju tipične znakove ZHN-a ili VHS-a.

I.2. Pripremanje i slanje uzoraka riba

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju I. točki 3.ovoga Dodatka.

I.3. Uzimanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju I. točki 4. ovoga Dodatka.

II. Pripremanje uzoraka za virološko pretraživanje

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju II. ovoga Dodatka.

III. Virološko pretraživanje

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju III. ovoga Dodatka.

IV. Identifikacija virusa

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju IV. ovoga Dodatka.

Odjeljak B. Izdvajanje virusa uz istodobnu serološku identifikaciju virusa

I.1. Odabir uzoraka

Kako je propisano u Odjeljku A. točki I.1. ovoga Dijela.

I.2. Pripremanje i slanje uzoraka riba

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju I. točki 3. ovoga Dodatka.

I.3. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju I. točki 4. ovoga Dodatka.

II.1. Homogenizacija organa

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju II. točki 2. ovoga Dodatka.

II.2. Centrifugiranje homogenata

Homogenat se centrifugira na 2000 do 4000 x g 15 minuta u centrifugi ohlađenoj pri 2 do 5 °C te se supernatant odlije i tretira antibioticima, npr. gentamicinom 1 mg/ml, četiri sata na 15 °C ili se filtrira kroz membranu (0,45 μm) s niskom sposobnošću vezanja proteina.

II.3. Obrada supernatanta dijagnostičkim antiserumom

Suspenzija organa obrađena antibioticima ili filtrirana kroz membranski filtar razrjeđuje se u omjeru 1:10 i 1:1000 u mediju za staničnu kulturu te se alikvoti pomiješaju i inkubiraju 60 minuta na 15°C s jednakim dijelovima reagensa navedenih u Dijelu I. Poglavlju IV. točki 2. ovoga Dodatka.

III.1. Stanične kulture i medij

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju III. točki 1. ovoga Dodatka.

III.2. Inokulacija staničnih kultura

Iz svake mješavine virusa i seruma (pripremljene kako je propisano u točki II.3. ovoga Odjeljka) inokuliraju se najmanje dvije stanične kulture po staničnoj liniji, svaka s 50 μl.

III.3. Inkubacija staničnih kultura

Kako je propisano u Dijelu I. Poglavlju III. točki 1. ovoga Dodatka.

III.4. Mikroskopiranje

Inokulirane stanične kulture svakodnevno se pregledavaju na pojavu citopatogenog učinka (CPU) pri povećanju od 40 do 150 puta. Ako jedan od korištenih antiseruma spriječi nastanak citopatogenog učinka (CPU), može se smatrati da je virus identificiran.

Ukoliko citopatogeni učinak nije spriječen nekim od antiseruma, potrebno je provesti identifikaciju virusa postupcima kako je opisano u Dijelu I. Poglavlju IV. ovoga Dodatka.

III.5. Supkultiviranje

Ukoliko se nakon 7 do 10 dana ne pojavi citopatogeni učinak (CPU), mora se provesti supkultiviranje s kulturama inokuliranim sa supernatantom i medijem (točka II.3. ovoga Odjeljka) u skladu s Dijelom I. Poglavljem III. točkom 5. ovoga Dodatka.

Odjeljak C. Druge dijagnostičke metode

Supernatant pripremljen kako je opisano u Dijelu I. Poglavlju II. točki 2. ovoga Dodatka može se pregledati metodom IFAT ili ELISA u skladu s Dijelom I. Poglavljem IV. Točkom 3. ovoga Dodatka ili Dijelom I. Poglavljem IV. točkom 4. ovoga Dodatka. Ove se brze metode trebaju dopuniti virološkim pretraživanjem u skladu s Odjeljcima A. ili B. ovoga Dijela u roku od 48 sati od uzorkovanja ako:

(a) se dobije negativan rezultat, ili

(b) se dobije pozitivan rezultat iz materija koji predstavlja prvi slučaj ZHN-a ili VHS-a u odobrenoj zoni.

Materijal tkiva se može podvrgnuti drugim dijagnostičkim metodama, kao što su: RT-PCR, IF na zamrznutim rezovima, imunohistokemija na formalinom fiksiranom materijalu tkiva. Navedeni postupci moraju se uvijek dopuniti inokulacijom nefiksiranog materijala tkiva na staničnim kulturama.

DIO III. Dokumentirana odsutnost VHS-a i/ili ZHN-a u zonama ili u uzgajalištima u neodobrenim zonama

Smjernice i kriteriji za program službenih zdravstvenih pregleda

1. Program zdravstvenih pregleda može se započeti:

– nakon što se provede službeno priznati program iskorjenjivanja VHS-a i/ili ZHN-a, u okviru kojega se uklonila sva riba iz uzgajališta, provelo čišćenje, dezinfekcija i odmor objekta prije ponovnog naseljavanja ribom podrijetlom iz odobrenih uzgajališta, ili

– u uzgajalištima u kojima u prošlosti nisu utvrđene infekcije virusima VHS-a ili ZHN-a.

2. Program zdravstvenih pregleda mora se temeljiti na kliničkim pregledima i laboratorijskim pretragama.

3. Program mora uključivati dva godišnja zdravstvena pregleda u skladu sa smjernicama koje su navedene u Dijelu I. ovoga Dodatka.

4. Pri najmanje jednom od pregleda koji se obavljaju svake godine, na svakom se uzgajalištu mora uzeti 30 uzoraka tkiva riba i/ili ovarijalne tekućine. Uzroci se biraju, pripremaju i laboratorijski pretražuju u skladu s Dijelom I., II. i IV. ovoga Dodatka.

5. Program zdravstvenih pregleda provodi se najmanje četiri godine na svim uzgajalištima u zoni odnosno na uzgajalištu u neodobrenoj zoni koja treba biti odobrena.

6. U svrhu službenog priznavanja programa, ne smije se pojaviti niti utvrditi niti jedan slučaj VHS-a ili ZHN-a (bilo klinička infekcija bilo izolacija virusa).

DIO IV. Postupak titracije za provjeru osjetljivosti staničnih kultura na infekciju

Preporučeni postupci titracije navedeni u Dijelu I. Poglavlju III. točki 3. ovoga Dodatka su sljedeći:

Treba koristiti najmanje dva izolata virusa VHS-a i jedan izolat virusa ZHN-a. Izolati trebaju predstavljati glavnu skupinu virusa unutar EU, npr. za virus VHS-a treba odabrati jedan patogeni izolat koji potječe od kalifornijske pastrve iz slatke vode i jedan izolat koji je patogen za romba iz morske vode, a za virus ZHN-a treba odabrati jedan europski soj koji je patogen za kalifornijsku pastrvu. Treba koristiti dobro definirane izolate podrijetlom iz država članica EU. Referentni izolati mogu se dobiti od referentnog laboratorija EU za bolesti riba.

Serije virusa u staničnim kulturama niske pasaže umnažaju se u bocama za staničnu kulturu na BF-2 ili RTG-2 stanicama za virus VHS-a i na EPC ili FHM stanicama za virus ZHN-a. Treba koristiti medij za staničnu kulturu s najmanje 10% seruma. Za inokulaciju treba koristiti niski MOI (< 1).

Kod punog citopatogenog učinka (CPU), virus se sakuplja centrifugiranjem supernatanta stanične kulture na 2 000 x g 15 minuta, sterilizira se filtriranjem kroz membranski filtar od 0,45 μm te raspodijeli u označene krioepruvete. Virus se čuva na – 80°C.

Tjedan dana nakon zamrzavanja, hladnom vodom otope se po tri epruvete svakog virusa te se titriraju na odgovarajućim staničnim linijama. Najmanje svakih šest mjeseci ili ako se sumnja da je osjetljivost stanične linije smanjena, svaki izolat virusa mora se otopiti i titrirati.

Postupci titracije moraju se detaljno opisati i svaki se put mora primijeniti isti postupak.

Titracija sa razrjeđenjem do završne točke treba uključivati najmanje šest ponavljanja u svakoj fazi razrjeđenja. Titri se uspoređuju s prethodno dobivenim titrima. Ako titar bilo kojeg od tri izolata virusa padne za faktor od 2 log ili više u odnosu na početni titar, stanična se linija ne bi trebala više koristiti u svrhu nadziranja.

Ako se u laboratoriju drže različite stanične linije, svaku bi liniju trebalo ispitivati odvojeno.

Evidencija se čuva najmanje 10 godina.

DIO V. Akronimi i kratice

1 Može se koristiti i manja veličina uzorka kao što je navedeno u tablici 1B, ako su ispunjeni uvjeti navedeni u Dijelu I. Poglavlju I. točki 1. i točki 2.1. podtočki (b), te Poglavlju III. ovoga Dodatka.

2 Klinički pregledi.

3,16,17 U iznimnim okolnostima, ako nije moguće dobiti ovarijalnu tekućinu, umjesto nje se mogu uzorkovati organi.

18 Uzorci se ne smiju uzeti prije nego proteknu tri tjedna od prijenosa ribe iz slatke u slanu vodu

7 Klinički pregledi.

8 U iznimnim okolnostima, ako nije moguće dobiti ovarijalnu tekućinu, umjesto nje se mogu uzorkovati organi.

9 Uzorci se ne smiju uzimati prije nego proteknu tri tjedna od prijenosa ribe iz slatke u slanu vodu.

10 U odobrenim zonama uzorke treba prikupljati rotirajući iz 50% uzgajališta godišnje. U odobrenim uzgajalištima smještenim u neodobrenim zonama uzorci moraju biti prikupljeni svake godine.

11 U iznimnim okolnostima, ukoliko nije moguće dobiti ovarijalnu tekućinu, umjesto nje se mogu uzorkovati organi.

12 Uzorci se ne smiju prikupiti prije nego proteknu tri tjedna od prijenosa ribe iz slatke u slanu vodu.

[1] Pravilnikom se preuzimaju odredbe Odluke komisije 2001/183/EZ od 22. veljače 2001. kojom se utvrđuju planovi uzorkovanja i dijagnostičke metode za otkrivanje i potvrđivanje prisutnosti određenih bolesti riba i kojom se ukida Odluka 92/532/EEZ.

[2] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja

[3] Člancima 49., 50. i 51. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe članaka 49., 50. i 51. Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006.o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja

[4],5 Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja

 

[6] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja;

[7] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja

[8] U iznimnim slučajevima, npr. ako se ribe uzorkuju u veoma udaljenim područjima i ne mogu se svakodnevno slati.

[9],10,11 Ili kako odredi referentni laboratorij s obzirom na moguću citotoksičnost antiseruma

   

[12] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja.

[13] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja;

[14] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/08) preuzete su odredbe Direktive (EZ) br. 2006/88 od 24. listopada 2006. o uvjetima za zdravlje akvakulture i njihovih proizvoda, sprječavanje i kontrolu određenih bolesti akvatičnih životinja;

 

Izvor: http://narodne-novine.nn.hr/clanci/sluzbeni/378078.html